Eduard Pfeiffer wurde am 24. November 1835 als dreizehntes Kind des Hofbankdirektors Marx Pfeiffer geboren. Schon von Hause aus begütert, machte Eduard Pfeiffer als Bank- und Wirtschaftsfachmann eine große Karriere. Er gehörte 1869 zu den Gründern der Württembergischen Vereinsbank, deren Aufstieg wesentlich ihm zu verdanken war. Als Mitglied des Aufsichtsrates führender Unternehmen des Landes übte Eduard Pfeiffer einen bedeutenden Einfluss auf das Wirtschaftsleben aus. Eduard Pfeiffer war einer der reichsten Bürger im Königreich Württemberg.
Nach der Polytechnischen Schule in Stuttgart, wo er zwischen 1850 und 1852 zunächst als Ingenieur, dann als Kaufmann eingeschrieben war, absolvierte er 1857 die École Centrale des Arts et Manufactures in Paris als Diplomchemie-Ingenieur und studierte anschließend bis 1862 an den Universitäten in Leipzig, Heidelberg und Berlin Nationalökonomie und Finanzwissenschaft. Er unternahm zahlreiche Reisen innerhalb Deutschlands, nach Frankreich, Italien und England. Auf diesen Reisen begann er, sich mit Aspekten der sozialen und ökonomischen Situation in Europa vertraut zu machen. In England lernte er 1862 die Genossenschaftsbewegung kennen.
1866 gehörte er zu den Mitbegründern der nationalliberalen Deutschen Partei mit dem Ziel eines von Preußen geführten Nationalstaats. Zwischen 1868 und 1876 hatte er als erster jüdischer Bürger einen Sitz in der II. Kammer des württembergischen Landtags, was bis dahin gesetzlich verboten war.
Am 12. September 1872 heiratete Pfeiffer Julie Benary geb. Kann (1843–1926), die junge Witwe des 1869 früh verstorbenen Bankiers Louis Ferdinand Victor Benary. 1883 wurde ihm der Titel eines Hofrats verliehen, der mit dem Personaladel verbunden war. Pfeiffer legte auf die Anrede „von“ allerdings nie Wert. 1894 verlieh ihm der König den Titel „Geheimer Hofrat“.
1909 dankte ihm die Stadt Stuttgart durch die Ehrenbürgerwürde nicht nur für sein jahrzehntelanges Mäzenatentum, sondern insbesondere auch für sein „weitblickendes und uneigennütziges“ Bemühen um die Stuttgarter Altstadtsanierung 1906 bis 1909. 1913 wurde Pfeiffer Ehrenbürger von Pinzolo am Fuß der Brenta, weil er über dessen Teilort Madonna di Campiglio – sein bevorzugter Urlaubsort – einen Reiseführer publiziert hatte.
Eduard Pfeiffer starb am 13. Mai 1921 und fand seine letzte Ruhestätte auf dem Pragfriedhof. Das Ehepaar blieb kinderlos. Für beide war es selbstverständlich, ihr beträchtliches Vermögen zum Wohl der Allgemeinheit einzusetzen, und so brachten sie es schon 1917 in die neu gegründete Eduard-Pfeiffer-Stiftung ein, die bis heute Bestand hat. König Wilhelm II. ehrte Pfeiffer deshalb mit dem selten vergebenen Titel „Exzellenz“.
Sein gesellschaftliches Engagement begann 1865, als auf seine Anregung hin in Stuttgart das Büro für Arbeitsnachweis – und damit ein Vorläufer des Arbeitsamts – geschaffen wurde. 1874 initiierte er ein Heim für Fabrikarbeiterinnen, 1890 das Arbeiterheim in der Stuttgarter Heusteigstraße. 1910/11 stiftete er den Bau eines weiteren großen Ledigenheims an der Villastraße, um die Missstände für Untermieter und Schlafgänger zu beseitigen. Vor allem aber gehen die vier großen Siedlungen Ost-, West- und Südheim sowie Ostenau und die Sanierung der Stuttgarter Innenstadt auf seine Initiative zurück.
Neben zahlreichen Maßnahmen im Wohnungsbau gehörte die Verbesserung des Gesundheitswesens zu Pfeiffers wichtigsten Zielen. Zur Reduzierung der Säuglingssterblichkeit und zur Verbesserung der Krankenhaushygiene finanzierte er 1910/12 an der Villastraße eine dringend notwendige Säuglingsheilanstalt. Pfeiffer gehörte auch zu den Gründern dreier öffentlicher Badeanstalten in Stuttgart sowie zweier Volksbibliotheken. Er organisierte den Verkauf von gesunder Milch an Säuglinge und Kinder und eröffnete eine Kinderkrippe sowie einen Kinderspielplatz.
Eduard Pfeiffer wird als Pionier einer unabhängigen Konsumgenossenschaftsbewegung angesehen. 1863 und 1865 erschienen die Schriften „Über Genossenschaftswesen“ sowie „Die Consumvereine, ihr Wesen und Wirken“. Weitere Publikationen zu volkswirtschaftlichen Themen folgten. Im November 1863 gründete er den Stuttgarter Consum- und Ersparnisverein, der zum Modell für die meisten Konsumgenossenschaften in Deutschland wurde. Pfeiffer wies darauf hin, dass er die Lösung der sozialen Frage nur durch die Kooperation von besitzenden und arbeitenden Klassen für denkbar hielt. Ziel seiner Anstrengungen blieb zeitlebens, die Arbeiterschaft durch stetige Verbesserungen ihrer Lebensumstände an das bürgerliche Gesellschaftssystem heranzuführen und zu binden und sie von revolutionären Ideen fernzuhalten.
1866 wurde auf Anregung Eduard Pfeiffers der „Verein für das Wohl der arbeitenden Klassen“ gegründet, dem er von 1876 bis 1921 selbst vorstand und der bis heute als „Bau- und Wohnungsverein Stuttgart“ besteht. Zur „Förderung der Interessen und Hebung der sittlichen und wirthschaftlichen Zustände der arbeitenden Klassen,“ wie es in den Statuten hieß, gehörte auch die Beschaffung von Wohnraum. Zwar hatte der Verein über 100 einflussreiche Mitglieder, doch es war Pfeiffer, der den größten Teil der Vereinsarbeit durch persönliche Stiftungen, Schenkungen und günstige Darlehen finanzierte, die Kontakte zu Unternehmen und Kaufleuten, Banken, dem Königshaus und der Stadt pflegte und seine Ideen, Theorien, Erlebnisse und praktischen Erfahrungen einbrachte. Die meisten Projekte bestehen noch heute. Die größten Anstrengungen unternahmen Pfeiffer und der Verein im Bereich der Wohnungsfürsorge in der rasant wachsenden Stadt.
1890 beschloss der Verein unter der Führung Pfeiffers das Siedlungsprojekt „Billige Wohnungen für kleine Leute“. Schon der Titel beschreibt, dass die Zielgruppen nicht allein unter den Arbeitern gesucht wurden, sondern unter den Geringverdienern jeder Art. So entstanden unter der Bauherrschaft des Vereins vier große Siedlungen in verschiedenen Teilen Stuttgarts: Ostheim (1891-1901 mit 1.300 Wohnungen), Südheim (1901-1904 mit 140 Wohnungen), Westheim (1902-1904 mit 100 Wohnungen) sowie die Kolonie Ostenau (1911-1913 mit 260 Wohnungen). Mit diesen Projekten konnte Pfeiffer zumindest bis 1914 nicht alle, aber – gemeinsam mit weiteren Siedlungen anderer Träger – einen Großteil der Probleme im Stuttgarter Wohnungswesen lösen.
Zu den wichtigsten Merkmalen der ersten drei Siedlungen gehörten ausreichend Wohnfläche, Kleingärten, ausreichend große Bauabstände für Lichteinfall und Luftzirkulation, praktische Grundrisse, individuelle Fassaden im Stil der bürgerlichen Wohnhäuser jener Zeit, teilweise mit Erkern, Ziergiebeln und Fachwerkapplikationen. Außerdem erhielten die Bewohner die Möglichkeit, die Häuser auf Raten zu kaufen, was sie schließlich zu Mitgliedern der „besitzenden Klasse“ machte. Mit der Siedlung Ostenau wandte er sich etwas gehobeneren Kreisen zu, indem er die Gebäude in nobleren, barockisierenden Formen mit Putzfassaden und großen Baukörpern erbauen ließ.
Die größte gemeinsame Unternehmung neben Ostheim war die umfassende Sanierung der Stuttgarter Altstadt zwischen 1906 und 1909, nach deren Realisierung Pfeiffer die Ehrenbürgerwürde verliehen wurde. Allerdings war es keine Sanierung im heutigen Sinne, sondern bedeutete den Abriss von rund einem Zehntel der Stuttgarter Altstadt und die völlige Neuplanung im Stile städtischer Wohn- und Geschäftshäuser der Spätrenaissance entlang der großen Handelsrouten im alpenländischen Raum. Als Teil des Projekts entstand am Rande des Sanierungsgebiets mit dem Graf-Eberhard-Bau eines der größten und modernsten Geschäftshäuser jener Zeit in Stuttgart.
1910 wurde anlässlich der Ehrenbürgerschaft eine neu angelegte Höhenstraße am Stuttgarter Kriegsberg nach Eduard Pfeiffer benannt, zwischen 1924 und 1938 auch das Arbeiterheim in der Heusteigstraße 45. Nachdem in den Jahren des Nationalsozialismus der Name Pfeiffers aufgrund seiner jüdischen Herkunft aus der Öffentlichkeit verbannt worden war, tragen heute wieder das Eduard-Pfeiffer-Haus in der Heusteigstraße sowie der Eduard-Pfeiffer-Platz (früher Teckplatz) in der Kolonie Ostheim und die Stadtbücherei Stuttgart-Ost als Eduard-Pfeiffer-Bibliothek seinen Namen.